Debido a los riesgos para el feto del diagnóstico prenatal invasivo, el diagnóstico prenatal no invasivo está obteniendo tremendo interés entre los investigadores, aunque hasta el momento no se ha desarrollado ningún método fiable que pueda ser implantado en la población general.
Los dos abordajes actuales del problema son el estudio de ADN libre en la circulación materna y la manipulación de células fetales. El estudio de células fetales completas tiene la ventaja de aportar una información genética completa, especialmente útil para el diagnóstico de aneuploidías. Sin embargo el número de células fetales en la circulación sanguínea de la madre es pequeño y su aislamiento y cultivo in vitro son difíciles, por lo que este tema se plantea aún como un reto para la investigación médica.
Por sus características, el eritroblasto fetal primitivo es el candidato ideal: Se trata de una célula nucleada, por lo que contiene la información genética del feto, no se encuentra en la sangre de adultos sanos, pero sí en sangre fetal a partir de la semana octava de gestación, y su corta vida media (aproximadamente 30 días), hace improbable el aislamiento de eritroblastos de embarazos previos. No obstante, su naturaleza, propiedades y manipulación para proporcionar un número adecuado de células aún es un tema no resuelto y los intentos de resolverlo no han sido satisfactorios hasta el momento.
El objetivo del presente proyecto es desarrollar una metodología fiable y coste-efectiva basada en un sistema de filtros que nos permiten aislar eritroblastos fetales en función de su tamaño, para posteriormente identificarlos, caracterizarlos genéticamente y tener la posibilidad de obtener cultivos celulares de los mismos, con el objetivo de disponer del material genético completo del feto mediante una muestra de sangre de la madre, que permita mediante análisis molecular (FISH y QF- PCR) el estudio de aneuploidías (síndrome de Down y otras) y estudio de otras enfermedades genéticas.
El Diagnóstico Prenatal (DP) es el método estándar para la detección de numerosos desórdenes congénitos en el feto durante la gestación. Una parte importante de este DP, especialmente el que se relaciona con la detección de anomalías cromosómicas, se basa en la realización de procedimientos invasivos (biopsia corial, amniocentesis, etc.) que implican un riesgo de perder el embarazo de 1 de cada 100 procedimientos (1).
Por todo ello han surgido recientemente investigaciones en el campo del Diagnóstico Prenatal no invasivo (DPNI), basadas en el diagnóstico de defectos congénitos mediante el estudio de material genético del feto presente en la circulación materna, de forma que con tan solo una muestra de sangre materna fuera posible el diagnóstico, evitando así los riesgos antes mencionados (2).
La primera aproximación al problema se realizó mediante el estudio del ADN libre fetal en sangre materna, en el que este grupo investigador ha tenido la oportunidad de trabajar. Esta técnica está establecida en el diagnóstico del sexo fetal, de utilidad en el DP de enfermedades genéticas recesivas ligadas al sexo (Hemofilia, Enfermedad de Duchenne, etc.) el diagnóstico del Rh del feto, de utilidad en el diagnóstico de la enfermedad hemolítica perinatal, y algunas otras enfermedades monogénicas (beta Talasemia, acondroplasia, etc.). Sin embargo este ADN libre está muy fragmentado, y su principal limitación es la de no proporcionar suficiente información genética para el diagnóstico de anomalías cromosómicas y enfermedades heredadas de la madre. Algunos autores han conseguido la secuenciación completa del genoma fetal mediante amplificación de los fragmentos de ADN circulantes (3), y utilizado para la detección del Síndrome de Down (4), pero el método es complejo y poco sensible (5,6), habiéndose situado en el terreno del cribado más que como prueba diagnóstica (7).
Por todo ello, la posibilidad de estudiar células fetales completas en sangre materna se considera una prometedora línea de investigación para el diagnóstico de aneuploidías en el feto, como el síndrome de Down, además de proporcionar una información genética completa y detallada del feto, tanto del núcleo como del citoplasma, que permitiría un diagnóstico genético complejo de cualquier anomalía que pudiera diagnosticarse en el adulto (8). Sin embargo existen algunas dificultades. Las células fetales en sangre materna lo están en número reducido y la principal dificultad radica en la separación de las células maternas.
La presencia de células fetales en sangre materna es conocida desde 1.893 en que se describió la presencia de células multinucleadas del sincitiotrofoblasto en tejido pulmonar de una mujer embarazada que murió de eclampsia (9). Desde entonces, en el torrente circulatorio de la madre se han descrito además de células trofoblásticas, linfocitos, eritroblastos primitivos y células madre hematopoyéticas.
Las células trofoblásticas no pasan habitualmente al torrente circulatorio materno. El principal inconveniente de su utilización es no disponer de marcadores específicos para identificarlas y la existencia de mosaicos en el tejido placentario que puede conducir a falsos diagnósticos (10). Los linfocitos fetales han sido utilizados en el diagnóstico del sexo fetal por su capacidad de proliferación in vitro (11). Sin embargo, su uso está limitado por su capacidad para persistir en el torrente circulatorio materno durante varios años, lo cual imposibilitaría su uso en gestantes que hayan tenido hijos previamente (12). Los eritroblastos fetales primitivos (EFP) tienen la ventaja de ser células con vida media corta, lo cual hace improbable encontrar células de un embarazo previo, se encuentran presentes en la sangre de la mujer embarazada desde fases muy precoces, lo están durante todo el embarazo, siendo especialmente abundantes durante el primer trimestre y presentan antígenos de superficie (CD71 y CD36), lo cual permite su caracterización. Todo ello los convierte en el candidato ideal para su uso en Diagnóstico prenatal no invasivo (8).
Aunque normalmente no se detectan EFP en sangre periférica de adultos sanos, su presencia durante el embarazo es un hecho constatado. Se ha descrito que entre un 74 y un 85% de los eritroblastos aislados en sangre materna son de origen fetal(13). No hay, de todas formas, consenso sobre la proporción de eritroblastos fetales en sangre materna, aunque algunos autores estiman que es del orden de 1 célula/ml desangre materna (14). En cuanto a su morfología exhiben un alto ratio nucleo/citoplasma con un núcleo compacto, condensación asimétrica de la cromatina y patrón de tinción característico con la cadena gamma de la hemoglobina fetal.
Así pues, aunque los eritroblastos primitivos fetales se consideran buenos candidatos potenciales para el DPNI precoz en el primer trimestre de la gestación, el procedimiento de selección y manipulación para proporcionar un número adecuado de células aún es un tema no resuelto y los intentos de resolverlo no han sido satisfactorios hasta el momento (15-18). Es por tanto necesario desarrollar técnicas de aislamiento que nos garanticen con un alto grado de fiabilidad y de forma no invasiva, la detección y posterior caracterización de estas células fetales. El análisis de estas células implica tres pasos fundamentales: a)Enriquecimiento celular, b) aislamiento celular y c) detección y caracterización genética y fenotípica celular: El enriquecimiento celular suele realizarse mediante la aplicación de gradientes de densidad como es el caso del ficoll o el percoll, tanto uno como otro implica pérdida celular, al introducir centrifugaciones y lavados post-enriquecimiento. Teniendo en cuenta que una de las principales limitaciones de este estudio es el número de células, la aplicación de este paso agrava el problema. Otra forma de enriquecimiento es la utilización de tampones de lisis, pero estos pueden terminar dañando también a los eritroblastos. El aislamiento celular se basa fundamentalmente en la aplicación de “sorting celular” dependiente de marcajes magnéticos (MACS) o de fluorescencia (FACS). El principal problema que presentan es que ambos necesitan un paso previo de enriquecimiento y que ambos necesitan la combinación con anticuerpos específicos de las células de interés (selección positiva), o la utilización de un proceso de selección negativa, aislando las células que no son de interés, para, posteriormente desecharlas El problema es, que las células positivas para el estudio al encontrarse en menor proporción, pueden quedar retenidas entre las células negativas, mucho más abundantes. No obstante, dentro de estos dos procesos, el método basado en la tecnología MACS, es más sensible y eficiente y no necesita una alta especialización, siendo un método reproducible y no excesivamente caro. El tercer paso es dependiente directamente de los dos pasos anteriores, y está además supeditado a la existencia de marcadores específicos de estas células.
Nuestro grupo, es pionero en el aislamiento, detección y caracterización de células tumorales circulantes (CTCs) de sangre periférica, de pacientes con cáncer sólidos (19,20). Dichas células, al igual que los eritroblastos, son extremadamente raras en la sangre. Basándonos en estos antecedentes y en nuestra experiencia, hemos desarrollado una metodología basada en el aislamiento por tamaño de células de origen fetal. Dicha metodología se basa en la tecnología desarrollada por ScreenCell® y que está especialmente diseñada para el aislamiento de CTCs y EFP (21). La técnica tiene como base fundamental el hecho de que los EFP presentan un tamaño especifico que les permite quedar retenidos en los diferentes poros que presenta el dispositivo que se pretende utilizar
Una de las principales ventajas que puede presentar esta metodología es la eliminación de pasos previos (enriquecimiento), lo que podría proporcionar una mayor sensibilidad, y por tanto un mayor índice de recogida celular. De esta forma consideramos posible que de esta forma puedan obtenerse células viables para su posterior cultivo, Asimismo, se puede realizar el estudio de otros marcadores fetales como ADN, en una misma muestra de sangre y en un solo paso, puesto que la sangre desechada tras el paso por el anillo de aislamiento queda intacta, pudiendo ser utilizada para otros estudios, como el anteriormente descrito.
Tras muchos años de investigación, el aislamiento de células fetales en sangre materna prácticamente se ha descartado debido a su escasez como un fenómeno biológico aceptado, y esta dificultad no se ha solventado eficazmente con los métodos disponibles. Por otro lado, la línea de investigación del estudio de los fragmentos de ADN fetal libre en la circulación materna no obtiene tampoco resultados esperanzadores en el campo del DPNI. Por todo ello, planteamos una nueva opción para establecer un diagnóstico prenatal basado en la obtención no invasiva de células fetales basada en un aislamiento eficaz de EFP en el primer trimestre de gestación que permita su estudio cromosómico y cultivo celular.
OBJETIVOS
– Conseguir un método de aislamiento de células fetales lo suficientemente eficaz, sensible y específico como para que pueda ser usado como método estándar de diagnóstico prenatal no invasivo de alteraciones genéticas.
– Una vez validado este procedimiento y obtenidas las células fetales (eritroblastos fetales), comprobar en ellas la realización de la técnica QF-PCR para el diagnóstico rápido de aneuploidías.
– Comprobar la realización de cultivo celular y posterior análisis mediante sondas FISH de diferentes alteraciones genéticas a través de las células fetales aisladas.
Participantes: CENTRO GENYO y LORGEN
ORGANISMO FINANCIADOR: Agencia IDEA (Consejería de Innovación, Ciencia y Empresa de la Junta de Andalucía)
CONVOCATORIA ORDEN DE INCENTIVOS DE 18 DE ENERO DE 2012
Nº de Identificación del expediente: 460427
Duración: 2013-2015
Contacto
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PTS, Av. de la Innovación, 1
18016 Granada – España